共识制定背景与目的

• 免疫细胞亚群检测在良恶性疾病诊疗、健康管理中具有重要价值
• 现有免疫细胞检测存在方案不统一、参考区间粗糙、结果难解释等问题，需开展外周血免疫细胞亚群精细化分析
• 多参数流式细胞术（MFC）是免疫细胞精细化亚群检测、免疫功能评价的核心技术，本共识旨在规范其检测方法与方案，促进临床应用

适用范围

• 适用于各类医疗机构临床实验室、第三方医学检验实验室、健康体检中心开展MFC精细化分析免疫细胞亚群的检测与研究

核心术语定义

• 外周血基础免疫细胞亚群：包含T、B、NK淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等常见免疫细胞，及对应特征性、功能性基础细胞亚群
• 精细化分析外周血免疫细胞亚群：在传统T、B、NK等基础免疫细胞亚群检测基础上，增加调节性T细胞、树突状细胞等细胞类型，检测分化发育、功能、活化相关标志物，进一步细分的免疫细胞亚群
• 群体参考区间：基于表观健康人群建立的指标分布范围，多采用95%健康个体测量值区间，受年龄、性别、地域等因素影响需定期验证更新
• 个体参考区间：待测个体健康时期的检测指标分布水平，可纳入实验室信息系统并动态更新
• 免疫年龄：机体免疫系统相对实际年龄的状态，可反映健康水平与衰老程度，可通过血液免疫生物标志物等方法评估
• 免疫衰老：随年龄增长出现的免疫系统功能下降改变，可导致抗感染、抗病能力衰退，CD57、Tim3等标志物与其相关
• 抗原表达强弱：描述正常免疫细胞亚群标志物表达强度时，统一使用高表达、低表达表述

免疫细胞亚群精细化分析总体要求

• 在传统CD3/CD4/CD8/CD19/CD16+CD56/CD45组成的简单淋巴细胞亚群检测基础上，增加分化发育、功能、活化相关标志物，根据临床需求选择不同组合开展精细化分析

免疫细胞亚群分类及临床意义

T细胞亚群

检测选择原则

• 最低检测要求：淋巴细胞占有核细胞比例与绝对数，总T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞、NK细胞占淋巴细胞比例和绝对数
• 建议增加指标：Treg细胞比例、活化与功能性T细胞比例等精细化分析指标

亚群区分与标志物选择

• T细胞基础分类：CD3⁺T细胞根据受体分为αβT细胞、γδT细胞；αβT细胞主要包含CD4⁺CD8⁻、CD4⁻CD8⁺细胞，及少量双阳性、双阴性αβT细胞；排除γδT细胞影响后，双阴性细胞比例超过淋巴细胞1.5%或T细胞2.5%，需结合临床排除自身免疫性淋巴细胞增生综合征
• 调节性T细胞：采用CD4⁺CD25⁺CD127low方案检测
• 功能性T细胞：根据CD28表达区分，CD28⁺为功能性T细胞（含初始T细胞、早期记忆细胞），CD28⁻为晚期记忆细胞、终末分化效应细胞
• 活化性T细胞：急性感染等早期活化评价选择CD69、CD25，其他情况常用HLA-DR、CD38
• 分化发育亚群：采用CD197/CD45RA将T细胞分为初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、终末分化效应记忆T细胞
• 辅助性T细胞亚群：可选择CD183/CD196膜标志物将CD4⁺T细胞分为Th1、Th2、Th17亚群
• 特殊场景可选标志物：胸腺功能评价可检测CD31，CAR-T相关研究可检测Tim3、CD57、PD-1等耗竭相关标志物，淋巴瘤等疾病克隆性筛查可检测TCR相关克隆性指标
• 进一步分类：总T细胞表型为CD3+，γδT细胞含TCRVδ1+、TCRVδ2+亚群，αβT细胞含TRBC1+、TRBC2+亚群；按CD4/CD8表达分为CD4+T（T4）、CD8+T（T8）、双阳性（DP，CD4+CD8+）、双阴性（DN，CD4-CD8-）T细胞，各亚群可进一步按CD45RA/CD197分为初始T（TN）、中央记忆T（TCM）、效应记忆T（TEM）、终末分化效应记忆T（TEMRA）亚群；功能亚群包括活化T（HLA-DR+、CD38+、双阳性活化）、CD57+T、CD279+T、CD28+T；T4可分为Th1、Th2、Th17、Th1Th17亚群，以及调节性T细胞（Treg，CD25+CD127low/-，含对应的TN、TCM、TEM、TEMRA亚群）
• 临床意义：各亚群异常与克隆性疾病、病毒感染、自身免疫病、肿瘤免疫、免疫衰老相关

B细胞亚群

• 基础特征：成熟B细胞表型为CD19+CD20+CD10+，胞膜轻链kappa/lambda比值正常范围0.3~3.0
• 亚群分类：按标志物分为CD27-初始B细胞、CD27+记忆B细胞，以及调节性B细胞亚群（过渡阶段B细胞CD38hiCD24hi、浆母细胞CD38hiCD20-等）
• 临床意义：各亚群异常与克隆性疾病、病毒感染、自身免疫病、肿瘤免疫相关

NK细胞亚群

• 基础特征：总NK细胞表型为CD3-CD16+和/或CD56+，按CD56/CD16表达分为NK1（CD56dimCD16+）、NK2（CD56brightCD16-）、NK3（CD56dimCD16-）、NK4（CD56brightCD16+），还可分为CD57+、CD279+等亚群
• 临床意义：各亚群异常与病毒感染、自身免疫病、肿瘤免疫、免疫衰老相关

单核细胞亚群

• 基础特征：总单核细胞表型为CD14+HLA-DR+，按CD14/CD16表达分为经典单核（CD14+CD16-，吞噬功能为主）、中间型单核（CD14+CD16+，分泌细胞因子、激活免疫）、非经典单核（CD14dimCD16+，抗原提呈功能增强）
• 临床意义：各亚群异常与病毒感染、自身免疫病、肿瘤免疫相关

树突状细胞（DC）亚群

• 基础特征：总DC定义为系别阴性（CD3-CD19-CD56-）HLA-DR+CD14-，按CD123/CD11c表达分为浆细胞样DC（pDC，CD123+CD11c-）、髓样DC（mDC，CD123-CD11c+）
• 临床意义：亚群异常与自身免疫病、肿瘤免疫相关

其他细胞

• 骨髓来源抑制细胞（MDSC）：表型为淋巴细胞系别阴性CD11b+HLA-DR-CD33+，分为多形核MDSC（CD15+CD14-）、单核MDSC（CD15-CD14+）、早期MDSC（CD15-CD14-），具有免疫抑制功能
• 中性粒细胞表型为HLA-DR-CD16+，其他还包括嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等，仅用于特殊检测场景

检测标志物选择共识

B细胞检测

• 常规精细化分析纳入CD27、CD24、CD38
• 疾病治疗、健康管理相关检测强烈建议纳入kappa、lambda、CD5，可识别单克隆B淋巴细胞增多症，高白细胞组（≥0.5×10^9/L）每年1%~2%进展为慢性淋巴细胞白血病
• 可酌情纳入IgD进一步区分记忆B细胞亚群

NK细胞、单核细胞、DC检测

• 基础免疫功能分析无需常规区分亚群
• 精细化分析按以下流程分群：CD16与CD56区分NK细胞亚群；系别阴性细胞群用HLA-DR+CD14+识别单核细胞、HLA-DR+CD14-识别DC（免疫抑制/低下患者HLA-DR表达可降低）；CD16和CD14分单核细胞亚群；CD123和CD11c分DC亚群

MDSC及其他细胞检测

• 常规基础及精细化免疫细胞分析不纳入MDSC及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等其他细胞群，仅用于特殊疾病研究、疾病治疗相关特殊检测
• 特殊疾病、健康管理相关的特殊免疫细胞检测，根据疾病特点及检测目的选择标志物组合

检测方案

方案设计原则

• 绝对计数与精细化分析分管检测，绝对计数管仅检测总T、B、NK细胞的比例和绝对计数，可采用单平台或双平台方法，操作及质控遵循国家指南
• 精细化免疫细胞亚群分析建议采用8色多参数流式细胞术（MFC）管完成，可分步开展检测，基础阶段选择相对简单的8色T亚群方案：CD45RA/CD3/CD4/CD8/CD28/CD197/CD38/HLA-DR，CD3/CD4/CD25/CD127/CD45；深度分析可选择多管8色以上方案，或20色以上全光谱/质谱流式方案获取上百个亚群；也可选择一管超多色方法，精细化亚群比例统计为占上一层级亚群的比例，使用其他检测平台可参照推荐方案调整

共识推荐8色多管方案

• 方案1（适配BD流式平台）：含T细胞管、Treg/Th管、DC/单核/NK管、TCR管、B细胞管、绝对计数管
• 方案2（适配贝克曼库尔特流式平台）：含T细胞管、Treg/Th管、DC/单核/NK管、TCR管、B细胞管、绝对计数管，其他平台可参考上述两个方案调整

数据分析

• 分析软件：可使用Diva、flowjo、kaluza等具备对应功能的软件，各类免疫细胞及亚群的免疫表型定义参考对应方案标准

基础免疫细胞亚群分析

• 绝对计数管可采用单平台或双平台方法，第一层级数据为淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、单个核细胞占有核细胞的比例和绝对数；第二层级数据为总T、CD4+T、CD8+T、B、NK细胞占淋巴细胞的比例和绝对数

精细化亚群分析

• T细胞管：依次设置单个细胞门、活细胞门，再通过SSC/CD3设T细胞门，区分CD4+T、CD8+T、DP、DN细胞，进一步分析各细胞的TN、TCM、TEM、TEMRA亚群，CD28表达情况，以及CD38/HLA-DR活化标志表达情况
• Treg/Th管：在单个活细胞门内分析CD4+T细胞，区分Treg细胞、T细胞记忆亚群，以及Th1、Th2、Th17、Th1Th17亚群，进一步分析记忆亚群中的Th组成、Treg的记忆亚群组成
• TCR管：区分γδT和αβT细胞，分析αβT的TRBC1表达情况、γδT的TCRVδ2表达情况，以及各亚群的CD57、CD279表达情况
• DC/NK/单核管：在单个核细胞门内设置系别阴性细胞门，区分NK细胞、单核细胞、DC，进一步区分NK细胞4个亚群、单核细胞3个亚群、pDC和mDC亚群
• B细胞管：在单个活细胞门内先设置CD19阳性B细胞门，外周血标本中出现浆细胞时可通过CD19/SSC设门去除SSC高、CD38阳性的浆细胞；B细胞门内用CD27/CD5区分CD27+记忆性B细胞、CD27-初始B细胞以及CD5+CD27-初始B前细胞；初始B细胞群中分析CD24高、CD38高的过渡阶段B细胞；记忆性B细胞中设置CD38+（CD20-）浆母细胞；调节性B细胞（Breg）分析建议分别提供CD24高CD27+和CD24高CD38高细胞群的比例；开展B细胞群及各亚群的kappa/lambda分析，重点关注CD5+细胞群，参考区间为0.3～3.0，检测kappa/lambda比值判断克隆性

检测操作注意事项

• 8色及以上MFC检测需裂解红细胞和离心洗涤，易造成细胞丢失和比例改变，各实验室需开展绝对计数管与8色及以上管的对比分析，根据变异系数规律进行校准
• 精细化免疫细胞亚群分析建议仅报告百分比，需绝对数值时根据占对应T、B、NK细胞群的比例换算
• 样本获取要求：建议获取3万～6万淋巴细胞或者22万～30万白细胞，外周血加样量可从常规100μl增至200μl甚至600μl，根据抗体滴定调整试剂用量
• 系别阴性抗体使用要求：DC、NK细胞检测组合到一管时，系别阴性细胞群设门采用CD3和CD19（和/或CD20）混合抗体，CD56单独使用，不宜使用CD3、CD19、CD56混合抗体
• 检测质控要求：关注设门顺序、设门精确度与补偿调节，开展系统性评价，可借助其他细胞群做阴性和阳性对照验证有效性；全光谱流式、质谱流式检测需特别注意方案设计和质量控制
• 髓源抑制细胞（MDSC）分析要求：需排除嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞（CD123）干扰，可采用标志物去除或根据两种细胞CD45/SSC特点设门去除

免疫衰老相关要求

• 免疫衰老会导致免疫细胞比例、计数及功能改变，建议将研究成熟的免疫衰老、免疫耗竭指标纳入精细化分析方案
• 参考区间需按年龄段细分，可建立逐年变化曲线，并定期修订
• 成熟的免疫衰老、耗竭标志物包括CD8+T细胞CD57、CD279（PD1）表达增加，CD28表达下降

疾病筛查应用相关共识

• 免疫细胞亚群检测结果判定参照物建议使用参考区间/参考范围，不使用“正常值”表述
• 建议开展精细化免疫细胞亚群分析建立人群参考区间（popRI），以此为参照结合指南共识解读个体检测结果，为临床诊疗和健康管理提供辅助信息
• 建议建立治疗及疾病恢复期监测时间点，以及无并发症患者的免疫细胞恢复参考变化值（RCV），用于预警疾病进展、发现并发症
• 建议逐步将克隆性相关指标kappa/lambda、TRBC1、TCRVδ1和/或TCRVδ2纳入检测，用于淋巴瘤及肿瘤前驱病变早期筛查
• αβT细胞TCRvβ亚单位、NK细胞KIR目前仅建议作为特殊研究项目，不纳入常规精细化分析